BioBricks: fabricação de uma parte padrão.

Até agora comentamos sobre a possibilidade de juntar diferentes componentes utilizando o padrão técnico de montagem dos BioBricks. Mas neste post vou comentar sobre a fabricação de uma parte padrão. No futuro, eu pretendo comentar sobre a síntese de DNA sintético, mas agora vou explicar como montar um BioBrick utilizando o método de PCR. O aparelho para realizar um PCR, o termociclador, está presente na maioria dos laboratórios de biologia molecular, e hoje se apresenta como uma ferramenta básica para este tipo de atividade. Existem centenas de livros e sites na Internet que podem te familiarizar com a técnica. Primeiramente, um BioBrick pode ser construído via PCR se existe algum molde de DNA do qual o BioBrick possa ser amplificado (por ex., um gene de alguma bactéria) ou se a parte é pequena o suficiente que possa ser criada através do alinhamento e extensão do primer (iniciador). Nos dois casos é necessário adicionar na extremidade 5′ dos primers as sequências referentes aos sítios das enzimas de restrição presentes nos BioBricks, os sufixos e prefixos (ver post anterior).

A construção de BioBricks contendo sequências codificadoras de proteínas requer um sufixo e um prefixo um pouco mais especializados por duas razões:

1. o prefixo é alterado para garantir o espaçamento entre o sítio de ligação do ribossomo e o códon ATG de início.

2. BioBricks que codificam proteínas possuem, por padronização, dois códons de sequência TAA de parada.

Ao construir os primers, basicamente, é necessário “copiar e colar” a seguinte sequência de 31 bp no fim 5′ no seu primer upstream (ou iniciador universal) desenhado para o seu fragmento de DNA de interesse:

5′ —> 3′
GTT TCT TCG AAT TCG CGG CCG CTT CTA G ATG…
start codon (no caso de um gene)
E “copiar e colar” os seguintes 35 bp no fim 5′ do seu primer downstream (iniciador reverso):

5′ —> 3′
GTT TCT TCC TGC AGC GGC CGC TAC TAG TA TTA TAA….
duplo stop codon!

A estas sequências deve-se somar aproximadamente 20 bp de sequência de primer relativa a região codificadora. Para este tipo de clonagem se utiliza uma Taq polimerase com alta fidelidade e um kit de clonagem TOPO-TA cloning.

Claro que todas as outras precauções para se desenhar um primer ainda são válidas, como a verificação de sítios de restrição nas sequências. Para mais detalhes, veja o protocolo disponibilizado para a fabricação de BioBricks.

Anúncios

Uma resposta em “BioBricks: fabricação de uma parte padrão.

Os comentários estão desativados.