Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

No post passado eu comentei sobre a técnica de PCR e de como programar um PCR. Neste post eu vou um pouco mais adiante e vou falar sobre como desenhar um iniciador (primer) e como montar uma reação de PCR.

O desenho do primer tem que ser feito com muito cuidado para garantir o futuro do projeto, erros no desenho podem ser percebidos apenas muito tempo depois, após muito esforço e dinheiro já ter sido gasto no projeto. Por isso, realize essa tarefa com muito cuidado, tendo em vista todo o projeto.

A primeira coisa é pegar a sequência de interesse no GenBank, como por exemplo para o gene codificador da enzima xilose isomerase de Escherichia coli. Conheça o gene, busque artigos sobre ele, veja os genes que estão envolta, como ele é regulado,… Depois salve a sequência do gene e mais ou menos 200 bp envolta dele em um documento word. Encontre o start códon, o stop códon, promotor,… e decida a sua estratégia de clonagem.

Para desenhar primers para amplificar o gene inteiro você precisará de regiões envolta do gene. Além disso existem uma série de regras a que você precisa ficar atento para desenhar o primer como: composição de G-C, tamanho do primer, temperatura de anelamento, formação de dímeros e estruturas secundárias e muito mais. Para este trabalho, eu recomendo utilizar um software, o FastPCR. Um software livre (gratuito) e amigável.

É preciso apenas colocar a sua sequência de interesse e pedir para que ele desenhe os primers, depois você precisa checar se aquela sequência amplifica a sua região de interesse. Para a encontrar o primer reverso na sua sequência tem uma ferramenta para obter o reverso complementar da sequência, já que as sequencias de primers são dadas no sentido 5´ – 3´.

Finalmente, você pode fazer um PCR in silico, para isso, volte para o Genbank e copie toda a sequência do genoma da bactéria desejada (isso pode demorar alguns minutos) e passe para o FastPCR para fazer o PCR in silico com os primers desenhados. Com isso, você pode verificar possíveis regiões amplificadas pelo seu par de primers.

Depois de mandar sintetizar os primers, você pode fazer um programa como mostrado no post anterior. Para a reação PCR você deve seguir o protocolo da sua Taq polimerase comprada. Vale a pena ressaltar que para amplificações de genes que serão expressos posteriormente, recomendo uma Taq polimerase de alta fidelidade.

No próximo post vou comentar sobre erros e soluções comuns que ocorrem com reações de PCR.

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4 respostas em “Como desenhar um primer? E como montar uma reação de PCR?

  1. Boa terde Mateus.

    Sobre desenho de primer e gostaria de lhe fazer uma pergunta.
    Após fazer o desenho dos primer como eu faço para saber qual o tamanho do fragmento que irei obter na reação de PCR, para após fazer um gel de agarose o fragmento que estou visualizando é realmente o que eu esperava.

    Agradeço desde já.

    • Olá Elisângela, vc precisa encontrar a sequência dos primers desenhados na sequência do fragmento a ser amplificado. O primer foward é fácil, a sequência é identica, agora, para a encontrar o primer reverso na sua sequência tem uma ferramenta para obter o reverso complementar da sequência, já que as sequencias de primers são dadas no sentido 5´ – 3´. Encotradas a regiões, conte o número de caracteres entre os primers, dessa maneira você encontrar o tamanho do seu fragmento. Boa sorte!

  2. Pingback: Problemas com PCR! | synbiobrasil

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