Problemas com PCR!

Após desenhar o seu primer,  montar a sua reação e programar o termociclador, você pode enfrentar problemas para otimizar as sua condições de PCR. Algumas simples ações podem resultar em um produto de PCR específico. Estas são as questões mais comuns aqui no laboratório:

1. Estou tendo (muitos) fragmentos inespecíficos maiores do que o esperado. O que fazer?

– Diminuir o tempo de anelamento da reação;

– Aumentar a temperatura de anelamento (aumento 2 graus a cada teste);

– Diminuir o tempo de extensão;

– Colocar menos primers;

– Checar e colocar menos DNA;

2. Estou obtendo fragmentos inespecíficos menores do que o esperado. O que fazer?

– Aumentar a temperatura de anelamento;

– Aumentar o tempo de anelamento;

– Aumentar a temperatura de extensão;

– Aumentar a temperatura de extensão para 74-78 oC;

– Colocar menos primers e/ou menos DNA.

3. A reação estava funcionando antes, mas agora eu não obtenho nenhum produto.

– Tenha certeza que todos os componentes estão na reação (tampão, DNA, primers…);

– Teste um novo Master Mix ou uma nova solução de dNTP (são sensíveis a descongelamentos consecutivos);

– Utilize um estoque novo de primers;

– Diminua sua temperatura de anelamento 6-10 oC, se não obtiver nenhum fragmento verifique todas os componentes.

Nos próximos posts vou comentar sobre técnicas de PCR: como RT-PCR, deleção de genes…

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