FAQs da Bioengenharia – Introdução

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Preocupados com os novos amantes da biologia sintética, estamos procurando materiais de introdução no assunto e encontramos algumas coisas interessantes! 🙂

Por isso vamos colocar uma sequência de posts explicativos, partindo de uma visão geral e seguindo por perguntas mais específicas. É um pequeno tutorial-FAQ sobre alguns fundamentos que quando entendidos ajudam bastante a entender algumas de nossas discussões e outros posts. Serve para ajudar principalmente quem não é da área de biológicas ou quem ainda não se aprofundou muito neste assunto! Se continuarem com dúvidas, perguntem tá?!

Lembrem-se de ativar as legendas dos vídeos, caso necessitem! Todos possuem legendas originais em inglês e alguns em português. Você pode colocá-las traduzidas quando só houver em inglês (não muito recomendado, rs). Nos vídeos do JOVI existe a opção de colocar os textos em português. Se você não sabia que o YouTube fazia isso por você, dá uma olhada aqui (dica: barrinha inferior do vídeo).

Antes de mais nada, você sabe o que são e quais as relações entre nossas principais moléculas orgânicas (DNA, RNA e proteínas), certo? Se sua resposta é não, assista um desses vídeos!

Indo além da Estrutura 

OK, agora vamos além desses conceitos básicos dos vídeos. Mais que entender a estrutura e a dinâmica dessas biomóleculas, como os cientistas a alteram? Em linhas gerais, como se faz para modificar geneticamente um organismo?

Vamos lá! Primeiro pegamos um pedacinho codificante de DNA (gene) de outro organismo que tenha certa característica que desejamos. Para isso, extraímos o DNA e depois multiplicamos só este pedaço que nos interessa através de uma técnica chamada PCR (afinal, a eficiência das transformações é pequena e quanto mais material melhor). Precisamos também extrair e abrir os plasmídeos (DNA circular) do organismo escolhido para receber este gene e assim receber as novas características (já que o plasmídeo é nosso principal veículo de introdução dos genes nas células). Para abrir estes plasmídeos usamos enzimas de restrição que cortam as moléculas de DNA em lugares específicos e chamamos isso de digestão. Depois que tivermos vários plasmídeos e genes, podemos grudá-los com a ajuda de enzimas de ligação. E então, para saber se nosso novo plasmídeo deu certo usamos uma técnica de separação por carga e tamanho de molécula, a eletroforese em gel. Nela, as moléculas se acumulam em certas posições que nos dizem seus tamanhos (mergulhadas em um polímero) e assim podemos identificar aquelas que correspondem ao que estimamos. Além disso, fazemos testes com a técnica PCR e o sequenciamento genético. Se os testes disserem que tudo que fizemos deu certo, recuperamos o material e colocamos nossos novos plasmídeos nos organismos, geralmente utilizando choque térmico ou elétrico. Esse passo, introdução de plasmídeos, é a chamada transformação. Mas para selecionarmos somente aqueles organismos que realmente foram transformados usamos antibióticos que eliminam as células que não ganharam os nossos novos plasmídeos, já que não possuem os genes de resistência que foram colocados neles. E no final, cada célula que sobreviveu se multiplicará, formando colônias de organismos geneticamente modificados. Agora dá uma olhada no esquema de novo e vê se entendeu até aqui!

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Calculadora para sítios de ligação com ribossomos (RBS)

RBSUm objetivo central da biologia sintética é programar células para desenvolver funções valiosas. À medida que se constroem sistemas genéticas maiores e mais complexos (como os de escala genômica), serão necessários modelos e técnicas para combinar as partes genéticas de maneira eficiente para se atingir um comportamento específico. Para isso, serão necessários modelos biofísicos que descrevam a relação de uma sequência de DNA que a sua função.

Um passo muito importante nesse sentido foi dado pelo Grupo do Prof. Howard Salis, pesquisador que eu tenho o prazer de trabalhar dentro do Synberc, com o desenvolvimento da calculadora de RBS (ribossomal binding site ou sítio de ligação com o ribossomo).

Engenharia genética de microrganismos é um processo tempo intensivo (por ex. o desenvolvimento de uma nova rota metabólica para a produção de um produto químico pode levar de 5 a 10 anos de P&D para chegar a etapa industrial) que normalmente requer múltiplas rodadas de tentativas e erro utilizando mutações aleatórias. À medida que se torna possível construir sistemas gênicos cada vez mais complexo (incluindo genomas completos), métodos automatizados para montagem desses sistemas e para otimização de vias metabólicas se tornam necessários para diminuir custos e tempo de desenvolvimento. Além disso, com o aumento da complexidade do sistema, a aplicação de métodos de tentativa e erro para sua otimização se torna cada mais difícil e ineficaz.

Uma maneira de otimizar um sistema gênico é através da variação da sequencia de seus elementos regulatórios para controlar os níveis de expressão de suas proteínas codificadoras. Cada passo limitante na expressão de um gene oferece a oportunidade para modular racionalmente os níveis de expressão proteica. Em bactérias, sítios de ligação do ribossomo  e outras sequencias regulatórias de RNA são elementos de controle eficientes para o início da tradução. Como consequência, essas sequências são comumente modificadas para a otimização de circuitos genéticos. Vias metabólicas e expressão de proteínas recombinantes. Assita um video bem interessante no Youtube sobre tradução. Não é mostrado no video (e não consegui encontrar um melhor) o RBS é uma sequencia do RNA que direciona o ribossomo para o start codon, ele complementar a região do rRNA 16S que é parte da subunidade pequena 30S do ribossomo. Basicamente, quando mais complementar o RBS é ao 16S rRNA, maior é a afinidade e maior é a taxa de tradução. 

Como foi descrito no video, a tradução em bactérias (procariotos) consiste em quatro fases: iniciação, elongamento, terminação e o turnover do ribossomo (na verdade, esta última fase não foi mostrada no video). Na maioria dos casos, o início da transcrição é o gargalo do processo inteiro. O taxa de iniciação de transcrição se dá pela combinação de diferentes efeitos moleculares: incluindo a hibridação do rRNA 16S  com a sequencia do RBS, a ligação do tRNA formilmetionina ao start codon, a distância entre o síto de ligação do rRNA 16S e o start códon, e a presença de estruturas secundárias de RNA que podem obstruir o RBS ou o start codon.    

Para o otimização de expressão de genes, é muito comum o desenvolvimento de bibliotecas de sequencias de RBS com o objetivo de otimização de funções de sistemas gênicos. Porém, a construção e seleção de bibliotecas de sequências se torna impraticável com o aumento de proteínas no sistema. Por exemplo, para realizar mutações randômicas em 4 nucleotídeos para um RBS resulta em uma biblioteca de 256 sequencias. O tamanho da biblioteca aumenta combinatoriamente com o número de proteínas do sistema, ou seja, 16,7 milhões de sequências para um sistema com 3 proteínas e 2,8 x 1014 sequencias para um sistemas com 6 proteínas). Dessa maneira, se torna necessários processos mais racionais para avaliar sequencias de RBS.

A calculadora de RBS utiliza um modelo estatístico termodinâmico para predizer a taxa de iniciação de tradução de uma proteína. Dado um RBS e a região codificadora da proteína, o modelo é capaz de calcular a mudança de energia livre durante a montagem do complexo ribossomal 30S no RNAm (ΔGTOT). Depois, o modelo estatístico é capaz de correlacionar a taxa de início de transcrição com o ΔGTOT. Dessa maneira, o modelo biofísico preenche uma lacuna de desenho racional de RBS, criando uma relação quantitativa entre um sequencia de letras (As, Gs, Cs e Us) e um número (taxa de iniciação de tradução).

A calculadora de RBS, portanto, combina um modelo biofísico com otimização estocástica para identificar uma sequência sintética (não natural) de RBS que irá proporcionar a taxa de início de tradução desejada. É importante destacar que esta relação também depende dos 35 nucleotídeos iniciais da região codificadora da proteína e que o RBS sintético precisa ser desenhada com esta sequencia incluída.
A calculadora de RBS está disponível do site do laboratório do Salis . E é muito simples de utilizar, basta criar uma conta de usuário, recortar e colar as sequências, e definir uma ou mais taxas de iniciação de transcrição.

RBS calculator

Outras ferramentas para controle de transcrição também estão disponíveis como a Small RNA Calculator.

Bons experimentos!

Salis, H., Mirsky, E., & Voigt, C. (2009). Automated design of synthetic ribosome binding sites to control protein expression Nature Biotechnology, 27 (10), 946-950 DOI: 10.1038/nbt.1568